白羽嘉 1,2,王敏 2,陶永霞 2,徐乐 3,冯作山 1*,2*
（ 1.新疆农业大学林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052;2.新疆农业大学食品科学与药学学院，
新疆 乌鲁木齐 830052:3.新疆农业科学院轮台果树资源圃，新疆 轮台 841600）
摘要：以轮台小白杏（甜杏仁品种）和甲麦黄杏（苦杏仁品种）为实验材料，采用同源基因克隆方法克隆野黑樱苷水解酶基因（Prunasin Hydrolase,PH）。轮台小白杏PH基因命名为PaLTPh（GenBank登录号：KF888615），序列长度3686bp;甲麦黄杏PH基因命名为PaMJPh（ KF888616 ），序列长度3690bp.PaLTPh和PaMJPh与扁桃PH691基因相似度为94%.根据PaLTPh和PaMJPh保守区序列设计引物，克隆CDS区序列。
PaLTPh CDS（KF888617）和PaMJPh CDS（KF888618）序列长度均为1635bp,与扁桃Ph691全CDS区相似性为97%.PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均为全长的开放阅读框ORF,编码蛋白质长度为544aa.PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含长度为26aa的信号肽和糖基水解酶家族Ⅰ结构域， 可催化野黑樱苷水解为扁桃腈和葡萄糖。杏PH基因与扁桃Ph691具有高度的同源性。
关键词：轮台小白杏、甲麦黄杏、野黑樱苷、野黑樱苷水解酶、基因克隆
杏仁营养丰富，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质 [1] ,通常被加工成杏仁油、杏仁露、盐焗杏仁等食品 [2-3] .杏仁根据苦杏仁苷含量的多少分为甜杏仁和苦杏仁，甜杏仁中苦杏仁苷﹤0.1%,而苦杏仁中苦杏仁苷含有在 2%~4% [4-5] . 研究发现苦杏仁苷具有一定的药理保健活性，具有镇咳、平喘、抗炎、镇痛、驱虫杀菌等功效 [6] .但过量摄入苦杏仁或苦杏仁苷，则会引起食物中毒，因此苦杏仁的安全性问题受到广泛的关注 [7-9] .
苦杏仁苷存在于蔷薇科植物杏、山杏、桃、山桃及李的种子中 [10] .苦杏仁苷（amygdalin）是一种生氰二糖苷， 结构式为苯羟基乙氰-β-D-葡萄糖-6-β-D-葡萄糖甙。 相关研究发现， 苦杏仁腈 （mandelonitrile）在 UDP-葡萄糖苷转移酶 GT1（glucuronide transferases,GT）作用下合成野黑樱苷，野黑樱苷在 GT2的催化下合成苦杏仁苷 [11] ;野黑樱苷作为苦杏仁苷的合成前体，能够被野黑樱苷水解酶（PrunasinHydrolases, PH） 水解生成扁桃腈和葡萄糖 [12-13] . 植物在生长发育过程中野黑樱苷水解酶 （EC 3.2.1.21）参与了苦杏仁苷及野黑樱苷的降解代谢，野黑樱苷水解酶调控野黑樱苷的浓度，进而影响苦杏仁苷的生物合成 [14-15] .相关研究鉴定出两个在甜扁桃和苦扁桃中差异的 PH 基因（Ph691 和 Ph692），对果实发育过程中外皮、珠心、胚乳和胚中 PHs 进行组织和细胞化学定位，发现 PH 蛋白在种仁不同发育时期的质外体和共质体之间产生移动 [16] .
图 1 苦杏仁腈、野黑樱苷和苦杏仁苷的代谢途径
新疆杏果树资源丰富，南疆环塔里木盆地周围有大面积的栽培，是新疆特色的果树品种之一[17] .杏果实除鲜食外，杏仁还是重要的木本粮油资源，杏仁粕含有大量的蛋白质可以被开发利用 [18] .
新疆杏品种丰富多样，但存在大量的苦杏仁品种，不利于食品加工和资源的综合利用。目前苦杏仁苷的研究主要集中在提取纯化 [19] 、分析检测 [20-21] 、安全控制及生物活性等方面 [22-23] ,对苦杏仁苷形成相关基因的报道并不多见。本研究以轮台小白杏（甜杏仁品种）和甲麦黄杏（苦杏仁品种）为实验材料，克隆野黑樱苷水解酶基因，对编码蛋白质进行预测分析，有助于了解杏仁中苦杏仁苷的合成与降解途径，为食品原料的生物检测、遗传育种和栽培种植提供研究基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
轮台小白杏果实（Prunus armeniaca L.cultivar LunTai Xiaobaixing,LT） 、甲麦黄杏果实（Prunusarmeniaca L.cultivar Jiamaihuangxing,MJ），于 2013 年 6 月 1 日采集自新疆农业科学院轮台果树资源圃（果树种质资源轮台果树资源圃）。
植物 DNA 提取试剂盒 （SK1203） 、 柱式植物总 RNA 抽提纯化试剂盒、 M-MuLV First Strand cDNASynthesis Kit M-MuLV 链 cDNA 合成试剂盒 （BS249） 、 AMV First Strand cDNA Synthesis Kit 链 cDNA 合成试剂盒、LA TaqDNA 聚合酶、UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒（SK1131） 、T-载体 pcr产物克隆试剂盒 （SK2211） 、 感受态细胞 DH5α、 一步法制备感受态细胞溶液 （SK2301） 、 DNA Marker、6×DNA Loading Dye、溴化乙锭 上海生物工程公司；ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X） 美国ABI 公司；琼脂糖 西班牙 BIOWEST 公司、三羟甲基氨基甲烷、冰乙酸、盐酸、EDTA-Na2 均为分析纯 国药集团。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS 高温灭菌锅 上海申安医疗器械公司；JH-SCA 净化工作台 上海鸿都电子科技有限公司； Biofuge Primo R 高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔； T-100 梯度 PCR 仪 美国伯乐公司； PowerPacUniversal 电泳仪 美国伯乐公司；Sub Cell GT 水平电泳槽 美国伯乐公司；Gene Genius Bio Image 凝胶成像系统 英国 SynGene 公司；U-3010 紫外-可见分光光度计 日本 Hitachi 公司；ABI Stepone plus型荧光定量 PCR 仪 美国 ABI 公司。
1.3 方法
1.3.1 野黑樱苷水解酶基因扩增引物设计
参考甜仁扁桃野黑樱苷水解酶基因序列（JQ268617.1、JQ268619.1、JQ268621.1、JQ268623.1）和苦仁扁桃野黑樱苷水解酶基因序列（JQ268618.1、JQ268620.1、JQ268622.1、JQ268624.1） ,设计野黑樱苷水解酶基因扩增引物 （表 1） . 引物设计扩增片段之间存在大于 200bp 碱基的重叠， 以保证 DNA拼接的准确性。
表 1 野黑樱苷水解酶基因 PCR 扩增引物
*注：LT1~LT 4为轮台小白杏野黑樱苷水解酶基因克隆引物；MJ1~MJ 4为甲麦黄杏野黑樱苷水解酶基因克隆引物；PaPhCDS
为野黑樱苷CDS序列 PCR引物
1.3.2野黑樱苷水解酶基因的克隆
取新鲜杏种仁液氮研磨，按植物DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA.PCR反应体系总体积25uL,包括：基因组DNA模板1uL,上下游引物（10 微米）各0.5μL,dNTP （10mM） 0.2μL,2×GC Buffer I12.5uL,ddH 2 O 10.1uL LA TaqDNA聚合酶（5U/μL） 0.2μL.PCR反应条件为：95℃，3min 94℃，30s、Tm℃，30s、72℃，90s（33个循环） 72℃，7min.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物电泳后采用试剂盒回收纯化DNA. 连接到pMD18-T载体，连接反应体系10.0?l,包括Solution I 4?l,PCR 产物 5?l,pMD18-T 0.2?l,H 2 O 0.8?l,16℃连接过夜。转化感受态细胞，倒置培养过夜。挑取阳性菌落，委托生工生物工程（上海）有限公司进行测序。
1.3.3杏野黑樱苷水解酶cDNA序列的克隆
取新鲜杏种仁液氮研磨，按柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒方法提取总RNA.cDNA链合成按试剂盒说明书进行。PCR扩增体系及克隆测序同1.3.1.
1.3.3 生物信息分析
序列拼接：克隆测序采用双向测序获得DNA片段序列，采用DNAMAN软件对序列进行拼接。
核酸生物信息分析：引物设计使用软件Primer Premier 5.0,序列拼接及比对分析使用DNAMANv7.0软件，序列检索通过在线NCBI进行，进化树构建使用MEAG 5.05软件。
蛋白生物信息分析：ORF分析使用ORF Finder在线分析，蛋白质结构预测使用SMART（SimpleModular Architecture Research Tool,SMART）在线分析 [24] ,蛋白质结构域使用Pfam 27.0 （March 2013,14831 families）进行在线分析 [25] ,信号肽的预测分析使用 SignalP 4.1 Server在线进行。
2 结果与分析
2.1 野黑樱苷水解酶基因的克隆
轮台小白杏基因组4对引物（LT1~LT4）分别扩增出1200bp、1500bp、350bp、1500bp的DNA片段，克隆测序后拼接获得长度为3686bp的DNA序列；甲麦黄杏基因组3对引物均扩增出1500bp大小的DNA片段，克隆测序后拼接获得长度为3690bp的DNA序列（图2） .
BLASTn鉴定核酸序列为野黑樱苷水解酶基因（表2） .轮台小白杏野黑樱苷水解酶基因PaLTPh（Pruns armeniana LT Prunasin Hydrolase, PaLTPh）与扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性为94%,与扁桃Ph692（JQ268619.1 、JQ268620.1）相似性为83%;甲麦黄杏野黑樱苷水解酶基因PaMJPh（Pruns armeniana MJ Prunasin Hydrolase, PaMJPh）与扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性为94%,与扁桃Ph692（JQ268619.1、JQ268620.1）相似性为分别为87%和83%.
注：M 为 DNA 标准分子质量；LT1~LT4 为轮台小白杏样品；MJ1~MJ3 为甲麦黄杏样品。
2.2 轮台小白杏与甲麦黄杏野黑樱苷水解酶 CDS 序列的克隆
根据野黑樱苷水解酶基因序列的保守型设计引物 PaPH CDS（表 1） ,以杏种仁 cDNA 为模板，克隆全 CDS 区序列。轮台小白杏和甲麦黄杏 cDNA 均扩增出 1600bp 左右的 DNA 片段，克隆测序后获得轮台小白杏PaLTPH CDS序列和甲麦黄杏PaMJPH CDS序列 （图3） . PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列长度均为 1635bp,BLASTn 检索鉴定与扁桃 Ph691 完整 CDS 序列（JQ268622.1、JQ268621.1）相似性为 97%.
根据PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列BLASTn搜索同源性较高的核酸序列，包括：扁桃（Prunusdulcis） 、 美国黑樱 （Prunus serotina） 、 甜樱桃 （Prunus avium） 、 苹果 （Malus x domestica） 、 草莓 （Fragaria）等物种的Phs.构建上述物种的核苷酸序系统进化树（图4），不同物种的野黑樱苷水解酶基因可分为4类， 扁桃Ph691和杏聚为一类， 美国黑樱和甜樱桃聚为一类， 苹果和草莓单独各聚为一类。 但扁桃Ph692较为特殊，进化分析中扁桃Ph692并没有与扁桃Ph691和杏聚为一类，而是进化为美国黑樱中的一个独立分支。
PaLTPh CDS 和 PaMJPh CDS 存在碱基差异（图 5） ,主要表现为转换（A-G/C-G）和颠换（A-C/G-T） ,未出现碱基缺失和插入。参考扁桃 Ph691 和 Ph692 序列进一步比对，发现杏 Ph 基因CDS 与扁桃 Ph691 CDS（JQ268621.1、JQ268622.1）核苷酸的差异表现为转换和颠换，与扁桃 Ph692CDS （JQ268623.1、 JQ268624.1） 核苷酸的差异则出现了碱基的插入 （序列位置： 1084-1086、 1103-110、1683-1643）和缺失（位置：80-82、1302-1307） .碱基的插入和缺失会导致该基因所翻译的蛋白质产生较大的差异。
2.3 杏野黑樱苷水解酶预测蛋白及分析
使用 NCBI 中 ORF Finder 软件对序列分析（图 6,图 7） ,PaLTPH CDS 序列和 PaMJPH CDS 序列包含起始密码子和终止密码子，为全长的开放阅读框 ORF（open reading frame,ORF） ,编码蛋白质长度为 544aa,两者相似性为 97.06%.
使用 Pfam 27.0 对编码蛋白序列进行分析（图 8）， PaLTPH 和 PaMJPH 均包含一个长度为 26aa（氨基酸残基 1-26aa）的信号肽及糖基水解酶家族Ⅰ（Pfam:Glyco_hydro_1）结构域。
在线 SignalP 4.1 Server 对蛋白序列信号肽进行预测分析（图 9、图 10） ,PaLTPH 和 PaMJPH 在1-26aa 序列 S 值较高（S-score），预测该氨基酸序列为信号肽。PaLTPH 信号肽序列 为MALQFRSLLLCVVLLLLGFSLANTNA , PaMJPH 信 号 肽 序 列 为MALQFRSLLLCVVLFLLGFALANTNA,比较发现第 13 个氨基酸残基（由 Ile 变成 Phe）和第 19 个氨基酸残基 （由 Ser 变成 Ala） 存在差异 （图 13） . 参考比对扁桃 PH 691 蛋白 （AFH35014.1、 AFH35015.1）信号肽发现，4 个蛋白的信号肽在 11、13 和 19 氨基酸残基存在差异。对比 CDS 序列分析，发现这种差异是由于核苷酸碱基 33、42、44、57、59 发生改变引起的。
信号肽在蛋白质的合成和转运过程中有重要的作用。编码分泌蛋白的 mRNA 在翻译时首先合成的是 N 末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合；信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外；翻译结束后，核糖体亚基解聚、孔道消失，内质网膜又恢复原先的脂双层结构 [26-28] .杏种仁和扁桃种仁中野黑樱苷水解酶含有信号肽，相似性为96.15%,野黑樱苷水解酶最终分泌到胞外，参与野黑樱苷的代谢。
野黑樱苷水解酶属 O-糖基水解酶（EC 3.2.1.） ,O-糖基水解酶是一个广泛的水解酶家族，能水解两个 （或两个以上） 糖形成的糖苷键， 或水解糖与非糖基团所形成的化学键， 生成单糖及非糖组分 [29] .对 PaLTPH 和 PaMJPH 的 Glyco_hydro_1 结构域进行分析（表 3），PaLTPH、PaMJPH 与 AFH35014.1、AFH35015.1同属于Glycosyl hydrolase family 1蛋白家族， HMM的长度为455aa, 预测活性位点为210aa和 426aa.杏与扁桃野黑樱苷水解酶蛋白具有高度相似的结构域及活性位点，推测杏种仁与扁桃种仁中野黑樱苷水解在苦杏仁苷的合成与代谢调控中起到相似的作用。
3 结论与讨论
3.1 采用同源基因克隆的方法从轮台小白杏中克隆获得PaLTPh,序列长度3686bp;从甲麦黄杏中克隆获得PaMJPh,序列长度3690bp.PaLTPh和PaMJPh与扁桃PH691基因相似度为94%,具有高度的同源性。
3.2 利用PaLTPh和PaMJPh序列的设计引物，以杏种仁cDNA为模板，克隆CDS区序列。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列长度均为1635bp, 与扁桃Ph691全CDS区 （JQ268622.1、 JQ268621.1） 相似性为97%.3.3 PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均包含起始密码子和终止密码子，为全长的开放阅读框ORF,编码蛋白质长度为544aa.PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含长度为26aa的信号肽和糖基水解酶家族Ⅰ（Pfam:Glyco_hydro_1）结构域，可催化野黑樱苷水解为扁桃腈和葡萄糖。
扁桃和杏同属蔷薇科核果类果树，其苦仁中所含的苦味物质都是苦杏仁苷。研究利用扁桃野黑樱苷水解酶基因，进行同源克隆，获得杏仁中野黑樱苷水解酶基因（PaLTPh、PaMJPh） ,其基因序列与扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性更高，蛋白预测分析显示其相似性为98.67,同属于Glyco_hydro_1家族。野黑樱苷水解酶作为苦杏仁苷合成关键基因，已从美洲黑樱（Prunus serotina）[30-32] , 甜樱桃 （Prunus avium） [33-34] 及扁桃 （Prunus dulcis） 中克隆到相关的基因， 随着桃 （Prunus persica）基因组测序与组装的完成，也预测出野黑樱苷水解酶相关基因 [35-37] .从杏种仁中克隆野黑樱苷水解酶基因，丰富了其基因的多样性，对杏仁种在发育过程中Ph基因的表达情况、细胞化学定位还有待于深入的研究。
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