摘要：目的：利用随机扩增多态性方法（RAPD）对西藏地区牦牛奶酪中 27 株乳酸菌基因型进行同源性分析。方法：利用 5 个随机引物对 Mg 2+ 浓度、dNTP 用量、退火温度、模版用量/引物用量（ng/pmol）四个条件做单因素梯度试验，建立反应条件，筛选引物，然后对 27 株乳酸菌和 4 株乳酸菌标准菌株进行随机扩增，用 NTsys2.10e 软件对扩增条带进行聚类和遗传相似性系数分析，分析结果同 16S rRNA 测序得到的菌种鉴定结果进行对比。结果：31 株菌遗传相似系数在 0.72-1.000 之间，当相似性系数在 0.82 时，菌株被分成了 8 组，菌株按照不同种属聚类，聚类结果同 16S rRNA 测序结果基本一致，同时成功将Lactobacillus casei 和 Lactobacillus paracasei 两个亚种区分开 .结论：RAPD 技术可以较好地应用于西藏地区牦牛奶酪中乳酸菌亲缘性关系分析。
关键词：西藏；牦牛奶酪；乳酸菌；随机扩增多态性；聚类分析
西藏牦牛素有“高原之舟”的美称，是我国重要的畜种。在高原地区牦牛乳及其制品是当地居民的重要食品。目前对于牦牛乳及其成分的报道日渐增多，但是对于牦牛奶酪中乳酸菌的报道却很少。乳酸菌作为奶酪发酵过程中的关键菌种，对其进行分类鉴定有着极其重要的意义。
随机扩增多态性（RAPD）技术最初是由美国科学家Williams [1] 和Welsh [2] 运用于基因多态性分析中。
它应用短的随机引物，通过 PCR 反应随机扩增后产生特异性的 D N A 图谱，具有多态性高、操作简单，引物没有严格限制，可以实现高通量测定等优点。扩增图谱重现性不高也是 RAPD 面临的一个问题，但是通过 PCR 反应程序和体系的优化，引物的筛选可以解决图谱重现性这个问题 [3-4] .目前很多国外学者将 RAPD 技术应用于乳酸菌基因型的研究中，如乳酸球菌属 （Lactococcus） [5] 、明串珠菌属[6] （Leuconostoc）、乳杆菌属 [7] （Lactobacillus）、肠球菌属 [8] （Enterococcus），很好地区别开亲缘性较近的菌种。但是国内只有很少文献报道了 RAPD 在乳酸菌基因分型中的应用。如高大威 [9] 等利用 RAPD 技术对鲜牛奶、西红柿和酸菜中分离出的乳酸菌进行聚类分析，确定了乳酸菌间亲缘性关系。秦丹 [10] 利用RAPD 方法对四川腊肉和香肠在加工和贮藏过程中的乳酸菌进行分析， 并将结果与传统微生物培养法进行比较，两种方法得到的结果不完全相同。
本研究通过筛选出随机引物 M13,单因素实验获得较好的图谱重现性后对 27 株分离纯化后的乳酸菌和 4 株乳酸菌标准菌株进行 RAPD 扩增，用 NTsys 2.10e 软件对扩增后图谱进行聚类分析，将聚类结果与各个菌株产地进行归类对比，同时与 16S rRNA 序列分析后的菌种鉴定结果结果进行对比，从而探讨 RAPD 技术在天然乳酸菌菌种分类鉴定方面的应用价值。
1 材料与方法
1.1 菌种与试剂
1.1.1 供试菌株
供试菌株分离自西藏牦牛奶酪，由西藏农牧学院提供（表 1）。标准菌株：Lactobacillus casei ATCC 393,Lactobacillus paracasei ATCC BAA-52,Lactobacillus plantarum ATCC 8014,Lactobacillusrhamnosus ATCC 7469 青岛海博生物技术有限公司购买。
1.1.2 试剂
Lambda DNA/Hind III Marker 北 京 鼎 国 生 物 科 技 有 限 公 司 ; Taq 酶 （ 5U/μL ） 、dNTPs（10mmol/L）、10×酶缓冲液、MgCl 2 （25mM） 宝生物工程（大连）有限公司；1kb DNA ladder、溶菌酶、EDTA Na 2 、Tris-base、Guanidine Thiocyanate、DEPC 加拿大 BBI;琼脂糖 西班牙 Agarose;蛋白酶 K 美国 Sigma; Gelred 核酸染料 美国 BIOTIUM; 细菌基因组提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。实验引物，100bp DNA ladder 生工生物工程（上海）股份有限公司。MRS 培养基的配制参照参考文献 [11] .
1.2 仪器和设备
HB031 金属恒温加热器 上海博彩生物技术有限公司；SIM-F140AY65 型制冰机 三洋国际贸易有限公司；1-15PK 小型台式离心机 德国 sigma 实验室离心机公司；Biospec-mini 型岛津 DNA/RNA/蛋白质分析装置，日本岛津制作所；S1000 高性能 PCR 仪，164-5050 伯乐基础电源电泳仪，SyngeneGeneGenius 凝胶成像系统， 美国 Syngene 有限公司； GL-88B 涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 乳酸菌 DNA 基因组提取
用试剂盒提取乳酸菌基因组 DNA,提取 DNA 保存于-20℃冰箱中。测定提取 DNA 的 OD 260 ,
OD 280 及 OD 260 /OD 280 数值，利用公式 c= OD 260 ×50（μg/mL） ×n（稀释倍数） [12] 计算出 DNA 浓度，为后续单因素实验提供数据。
1.3.2 乳酸菌 16S rRNA PCR
采用细菌 16S rDNA 基因的通用引物 [13] :正向引物为 27f（5-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3‘） ,反向引物为 1492r（5- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3’）对 27 株菌提取的 DNA 进行扩增，扩增产物用 2.0%琼脂糖进行凝胶电泳。将扩增产物送上海生物工程有限公司测序。
1.3.3 16S rRNA 序列同源性分析
登陆 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库，用 Blast 软件将 16S rRNA 测序结果与已知序列进行相似性分析 [11] ,同时对 27 个菌株的测序结果采用 UPGMA（Unweighted Pair Group Method withArithmetic Mean）法进行聚类分析，并构建各菌株的遗传距离聚类图。
1.3.3 RAPD 随机引物的筛选及 PCR 反应体系和条件的优化
随机引物的筛选：通过对 5 条不同随机扩增引物（表 2）进行 PCR 反应，根据条带的多态性和亮度选择出最适引物，进行后续单因素实验。
PCR 反应体系优化：预设 PCR 反应体系 [15] 为 5U/ μL Taq 酶 0.2μL,10 μmol/L 引物 0.5 μL,模版 DNA/引物用量=20,10×Taq 酶缓冲液（无 Mg 2+ ）2.5 μL,25mM MgCl 2 2.5 μL,2.5mmol/L dNTPs0.6 μL.
Mg 2+ 浓度优化：预设 PCR 反应体系中 Mg 2+ 浓度分别设为 1.0;1.5;2.0;2.5;3.0mM,其余试剂浓度保持不变，选择 Mg 2+ 浓度。
模版 DNA/引物用量比例优化： 预设 PCR 反应体系中模版 DNA/引物用量的比例分别设为 5; 10;20;40;80,其余试剂浓度保持不变，选择模版 DNA/引物用量比例。
dNTP 用量优化：预设 PCR 反应体系中 dNTP 用量分别设为 30;60;90;120;150μM;其余试剂浓度保持不变，选择 dNTP 用量。
PCR 反应条件优化：预设 PCR 反应程序 [15] 为 94℃预变性 3min,94℃变性 1:00min;50℃退火1:00min;72℃延伸 2:00min;35 个循环，然后 72℃延伸 10min.
退火温度的优化：预设 PCR 反应条件中退火温度分别设为 46;47;48;49;50℃，其余条件保持不变，选择退火温度。
PCR 扩增产物通过 1.0%琼脂糖凝胶电泳（70V,1h） ,gelred 染色后凝胶成像。通过电泳条带的数量，亮度，重复性和特异性条带来确定反应条件。
1.3.3 RAPD 扩增产物检测
扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。取 10 μL 扩增产物与 2 μL loading buffer 混匀，点样于凝胶孔，用 1kb DNA ladder 作为分子量标尺，电泳缓冲液为 1×TAE,70V 恒压电泳 60min,gelred染色后通过凝胶呈像系统拍照。
1.3.4 RAPD 谱带分析
各菌株的扩增图谱上特定位点无条带的赋值为 0, 有条带的赋值为 1, 用 NTsys2.10e 制作为 “0,1”文件，采用 UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）法进行聚类分析，并构建各菌株的遗传距离聚类图。
图 1a 显示 27 株菌的 DNA 提取结果， OD 260 /OD 280 的范围在 1.8-2.2 之间， 在 23000bp 处有明显的单一条带。图 1b 显示 27 株菌 16S rRNA 的 PCR 扩增结果，在 1500bp 处有明显的单一条带。说明各菌株基因组 DNA 均被成功提取出，同时成功扩增出目标片段。
2.1.3 16S rRNA 序列同源性分析
由图 2 可知，27 株菌分为 6 个大的分支，其中 21-1、16-4、17-1、26-1、15-1、21-2、123-4、12-2、122-1、20-1、13-3、23-3、11-2、24-3、12-1、02-1、14-3、19-2 位于一个分支，属于 Lactobacilluscasei 或者 Lactobacillus paracasei.125-2 处于一个分支，属于 Lactobacillus parabuchneri.16-1、16-2、19-1 位于一个分支， 属于 Lactobacillus diolivorans. 17-5、 28-1、 20-2 位于一个分支， 属于 Lactobacillusplantarum.14-1 位于一个分支，属于 Lactobacillus helveticus.123-2 位于一个分支，属于 Leuconostocmesenteroides.图中未能将 Lactobacillus casei 和 Lactobacillus paracasei 分开。
2.2 单因素反应电泳图
2.2.1 退火温度
通过图 3a 可以看出，退火温度由 46℃升到 48℃过程中，条带的亮度逐渐增加，温度由 48℃升到 50℃的过程中，条带的亮度和数量保持不变，同时条带整体重现性较好，考虑到退火温度较低时引物与模版结合更好，所以 PCR 反应中退火温度选用 48℃。
2.2.2 模版 DNA/引物用量（ng/pmol）比
由图 3b 可以看出电泳条带的整体重现性很好，在 5 倍和 10 倍的情况下出现 5 个条带，同时考虑到在 10 倍情况下条带亮度更佳，所以 25uL PCR 反应体系模版 DNA/引物用量的比例选用 10.
2.2.3 Mg 2+ 浓度
由图 3c 可以看出电泳条带整体重现性很好，随着 Mg 2+ 浓度的升高，条带的亮度逐渐增加，在Mg 2+ 浓度为 3.0mM 是效果，所以 25μL PCR 反应体系中 Mg 2+ 的浓度选用 3.0mM.
2.2.4 dNTP 用量
由图 3d 可以看出随着 dNTP 用量的增加条带的亮度显着增加，在 150uM 时达到最亮，同时条带整体重现性较好，在 150μM 条件下达到了 7 条，所以 25μL PCR 反应体系中 dNTP 用量选用 150μM.
经过单因素反应测试， 得到优化的 RAPD 扩增程序为： 94℃预变性 3min, 94℃变性 1:00min; 48℃退火 1:00min;72℃延伸 2:00min;35 个循环，然后 72℃延伸 10min.优化的 PCR 反应体系为：25μL总反应体积， 模版 DNA/引物用量=10,10×Taq 酶缓冲液（无 Mg 2+ ）2.5μL,25 mM MgCl 2 3.0μL,2.5mmol/L dNTPs 1.5μL,10μmol/L 引物 0.5μL,5U/μL Taq 酶 0.2μL,灭菌纯水补至 25μL.对 4 株乳酸菌标准菌株和 27 株分离乳酸菌进行 RAPD 扩增。
2.3 整体乳酸菌 RAPD 图谱
27 株西藏牦牛奶酪分离乳酸菌和四株乳酸菌标准菌株用 M13 引物扩增并电泳后， 所有菌株均扩增出明显的条带，同时 16S rRNA 鉴定出相同属的菌株之间可以看出明显的相似性，各个菌株之间也存在特异性，扩增出的条带数目在 3-10 条之间，所获得的片段分子量大小在 250-3000 之间，图 4 显示了 31 株乳酸菌扩增后的电泳图。
2.4 聚类分析
用 NTsys2.10e 软件，按照 UPMGA 法，对供试菌株之间的遗传相似系数矩阵进行聚类分析，得到聚类分析图 5.由图 5 可知，当相似性系数为 0.82 时，分离自牦牛奶酪的 27 株乳酸菌和 4 株乳酸菌标准菌株被分成了 8 个组。组包括 11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、 12-1、 19-2、 14-3、 17-1 和 casei 标准菌株， 它们都是 Lactobacillus casei. 第二组只有一支菌 123-2,为 Leuconostoc mesenteroides.第三组中 16-1、16-2、19-1、聚为分支，它们是 Lactobacillusdiolivorans.另一分支为 125-2,是 Lactobacillus parabuchneri,Lactobacillus rhamnosus 单独成为一个分支。第四组只有一支菌 14-1,为 Lactobacillus helveticus.第五组中 paracasei 标准菌株单独成为一分支，26-1 和 123-4 聚为另一分支，为 Lactobacillus paracasei.第六组只有一支菌 16-4,为 L.casei.
第七组只有一支菌 20-1,为 L.casei.第八组包括 17-5、28-1,、20-2 和 plantarum 标准菌株，它们都是Lactobacillus plantarum.通过聚类分析图和 16S rRNA 测序结果之间的相互比较可以发现 RAPD 聚类分析结果同16S rRNA测序结果基本一致， 但是16S rRNA 进化树图并不能够将Lactobacillus paracasei和 Lactobacillus casei 两个亚种区分开，而利用 RAPD 聚类分析结果可以将其区分开。由此可以得出在乳酸菌基因型分类鉴定中，RAPD 对于亲缘型很近菌株的鉴定效果要优于 16S rRNA 同源性分析，更适合于西藏牦牛奶酪中乳酸菌亲缘性关系分析。
3 讨论
西藏地区居民主要采用传统手工方法制作奶酪，由于产地、乳酸菌种、制作工艺的不同，导致奶酪风味和质地的多样化。乳酸菌又是奶酪制作过程中的核心，是奶酪品质好坏的关键。建立系统的鉴定方法对奶酪中乳酸菌进行分析，会对当地奶酪制品质量的提高起到很大的借鉴作用。
目前对于细菌的鉴定主要有表型鉴定和基因型鉴定两种方法。表型鉴定不仅在操作上具有一定的复杂性，同时在鉴定的水平上只能达到属的水平，难以达到种水平的鉴定 [16] .而 RAPD 技术运用随机引物对不同种群的基因组 DNA 进行扩增，不仅可以在分子水平上对菌株之间进行分类和鉴定，还可以整体基因组DNA进行多态性检测， 同时操作简易， 准确性高。 许多国外学者已经成功地将RAPD技术应用于乳酸菌的分离鉴定。如 Gevers [17] 等运用随机引物（GTG） 5 成功地完成对干香肠中乳杆菌亚种的分类和鉴定。Corroler [18] 等运用 RAPD 技术对不同季节采集的牛奶中 L.lactis subsp.lacti 和 L.lactissubsp.cremoris 两个亚种进行分类和鉴定。Cocconcelli [19] 等运用 RAPD 技术区分开嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、瑞士乳杆菌（L.helveticus）、干酪乳杆菌（L.casei） 、植物乳杆菌（L.plantarum）、粪肠球菌（Ent.faecalis）、屎肠球菌（Ent.faecium）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等菌株。Nigatu [20] 等利用 RAPD 技术对 45 株乳杆菌进行区分， 所有菌株均扩增出了不同的多态性条带， 并且相似度在 72%以上，对乳杆菌属进行了最集中和广泛的研究。
本研究利用 16S rRNA 和 RAPD 技术对西藏牦牛奶酪中乳酸菌的基因型和遗传多样性进行了分析，用 NTsys 2.10e 软件计算出了 31 株乳酸菌菌株之间的遗传相似系数矩阵，并用 UPMGA 法作聚类分析图，与 16S rRNA 序列分析结果相对比。在与 16S rRNA 序列分析结果的比较中，两种基因型方法得出的结果基本是一致的。同时在 RAPD 的聚类图中将 L.casei 和 L.paracasei 这两个亚种有效的区分开来，这是 16S rRNA 技术在进行同源性分析时是做不到的，同时相关文献中也无类似报道。综合比较结果考虑，RAPD 技术在乳酸菌分类鉴定中有一定的应用价值，同时它有操作简单快速、种间和种内区分效率高、费用低的优势，与其他表型和基因型方法相结合，可提高菌种鉴定效率和准确性。
参考文献
[1] WILLIAMS J G K, KUBELIK A R, LIVAK K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Research, 1990,18（22）：6531-6535.
[2] WELSH J, MCCLELLAND M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nucleic Acids Research, 1990,18（24）： 7213-7218.
[3] TYLER KD, WANG G, TYLER SD, et al. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification- based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35（2）： 339-346.
[4] MICHELI MR, BOVA R, PASCALE E, et al. Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified polymorphic DNA（RAPD） method [J]. Nucleic Acid Research, 1994, 22（10）： 1921-1922.
[5] PSONI L, KOTZAMANIDIS C, YIANGOU M, et al. Genotypic and phenotypic diversity of lactococcus lactis isolates from Batzos, a Greek PDO raw goat milk cheese[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 114（2）： 211-220.
[6] TRIAS R, BADOSA E, MONTESINOS E, et al. Bioprotective Leuconostoc strains against Listeria monocytogenes in fresh fruits and vegetables[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 127（1-2）： 91-98.
[7] LPPEZ I, TORRES C, RUIZ-LARREA F. Genetic typification by pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） and randomly amplified polymorphic DNA （RAPD） of wild Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni wine strains[J]. European Food Research and Technology, 2008, 227（2）： 547-555.
[8] HOSSEINI S V, ARLINDO S, BOHME K, et al. Molecular and probiotic characterization of bacteriocin-producing Enterococcus faecium strains isolated from nonfermented animal foods[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 107（4）： 1392-1403.
[9] 高大威， 朱光华， 王立欣， 等。 三种食物中乳酸菌的亲缘性关系及抗氧化活性研究[J]. 燕山大学学报， 2012, 36 （1） : 84-88.
[10] 秦丹。四川腊肉和香肠加工贮藏过程中微生物系统的 RAPD 分析[D].四川：四川农业大学，2011:21-53.
[11] 李平兰，贺稚非。 食品微生物学实验原理与技术[M]. 北京： 中国农业出版社， 2005: 264.
[12] 林万明。 细菌分子遗传学分类鉴定法[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1990: 48-83.
[13] AO X, ZHANG X, ZHANG X, et al. Identification of lactic acid bacteria in traditional fermented yak milk and evaluation of their application in fermented milk products [J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95（3）： 1073-1084.
[14] WARD L J H, TIMMINS M J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction [J]. Letters in Applied Microbiology, 1999, 29: 90-92.
[15] 朱红梅，廖万清，戴建新，等。 用微小卫星引物 PCR 鉴定红色毛癣菌和须癣毛癣菌[J]. 第二军医大学学报，2001,22（3）：252-254.
[16] 王庭柱。乳源球菌菌株的多相分类鉴定[D].哈尔滨：东北农业大学，2006.
[17] GEVER D, HUYS G, SWINGS J. Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species[J]. Fems Microbiology Letters, 2001, 205（1）： 31-36.
[18] CORROLER D, MANGIN I, DESMASURES N, et al. An ecological study of lactococci isolated from raw milk in the Camembert cheese Registered Designation of Origin area[J]. 1998, 64（12）： 4729-4735.
[19] COCCONCELLI P S, PORRO D, GALANDINI S, et al. Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic-acid bacteria and enterococci[J]. Letters in Applied Microbiology, 1995, 21（6）： 376-379.
[20] NIGATU A, AHRNé S, MOLIN G. Randomly amplified polymorphic DNA （RAPD） profiles for the distinction of Lactobacillus species [J]. Antonie van Leeuwenhoek 2001, 79: 1-6.